Miért nem sikerül következetesen a WB kísérlete? Nézze meg a következő okokat!

Ma beszéljünk arról a problémáról, amely számtalan kutatási kollégát okoz - a Western Blot (WB) kísérletet. Ez a látszólag egyszerű, de tele van "csapdák" kísérletekkel, miért mindig újra és újra megbotlik? Most nézzük át a kudarc okait.

I. Nincsenek zenekarok

A lehetséges okok között szerepelhet:

1. Antitest problémák: Az antitest lehet hatástalan, nem specifikus, vagy nem kötődik a célfehérjéhez.
2. Minta problémái: A minta tartalmazhat zavaró anyagokat, túl alacsony koncentrációban lehet, vagy már lebomlott.
3. Elektroforézis problémái: Nem megfelelő elektroforézis -körülmények, például feszültség, idő vagy nem megfelelő puffer használata.
4. Átadási problémák: Problémák az átviteli folyamat során, például a nem megfelelő membránválasztás, az átviteli idő vagy az átviteli puffer.
5. Blokkolási problémák: A blokkoló megoldás nem megfelelő lehet, vagy a blokkolási idő túl hosszú lehet.
6. Festési problémák: A festési reagens lejárt, érzéketlen vagy nem megfelelően használható.

Berendezések problémái: A berendezés meghibásodhat vagy nem lehet megfelelően kalibrálni.

1. Kísérleti működési kérdések: A kísérleti művelet nem szabványosítható, például nem megfelelő mosás vagy egyenetlen minta terhelés.
2. Fehérje módosítási problémái: A célfehérje poszt-transzlációs módosításokon eshet át, amelyek megakadályozzák az ellenanyagok felismerését.
3. Célfehérje expressziós problémái: A célfehérjének nagyon alacsony expressziója lehet, vagy nincs expressziója a sejtekben vagy szövetekben.

Ii. Magas háttér

A lehetséges okok között szerepelhet:

1. Magas antitestkoncentráció: A túl sok antitest használata növelheti a nem specifikus kötődést, ami magas háttérrel jár.
2. Antitest minőségi problémái: Az antitestnek magas nem specifikus kötődése vagy keresztreakciója lehet más fehérjékkel.
3. Nem elegendő blokkolás: A blokkoló oldat nem fedezi hatékonyan a nem specifikus kötőhelyeket a membránon, ami magas hátteret eredményez.
4. Membránproblémák: A membránnak rossz minősége vagy szennyeződése lehet, ami magas háttérhez vezet.
5. Hiányos transzfer: A transzfer folyamat során a fehérjék nem kerülhetnek át a membránra, ami magas háttérrel jár.
6. Nem elegendő mosás: A mosási lépések nem tudják hatékonyan eltávolítani a nem kötött antitesteket vagy más szennyeződéseket, ami magas háttérhez vezet.
7. A reagens problémáinak festése: A festési reagens túl érzékeny vagy instabil lehet, ami magas hátteret eredményez.
8. Kísérleti berendezések problémái: A berendezés szivárgás vagy interferencia lehet, ami magas háttérhez vezet.
9. Fehérjeminta problémái: A minta nagy mennyiségű zavaró anyagot tartalmazhat, például fehérjebomlás -termékeket vagy más szennyeződéseket.
10. Kísérleti műveletek kérdései: A kísérleti művelet nem szabványosítható, például hosszan tartó inkubációs idő vagy magas hőmérséklet.

Iii. Nem specifikus sávok vagy helytelen protein sávméretek

A lehetséges okok között szerepelhet:

1. Túl sok sejt passzál, ami különböző fehérje expressziós szintet eredményez, amely következetlen sávméreteket vagy több sáv jelenlétét eredményezi.
2. A fehérjeminta lebomlása, ami alacsonyabb protein molekulatömeg vagy több sáv jelenlétét eredményezi.
3. Az in vivo expresszált fehérjemintáknak különféle módosítások formái lehetnek, mint például acetilezés, metilezés, alkilezés, foszforiláció és glikozilezés, ami következetlen sávméreteket vagy több sáv jelenlétét eredményezi.
4. A célfehérje több izoformát vagy splice variánsot tartalmaz, amelyek következetlen sávméreteket vagy több sáv jelenlétét eredményezik.